科研費（文科省・学振）獲得実績 - 坂本 崇
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魚類における耐病性責任遺伝子を用いた宿主と病原体の史的攻防メカニズムの解明
研究期間: 2024年04月 - 2028年03月 代表者: 坂本 崇
基盤研究(A) 研究代表者 24H00521
自然河川で過去に採集された野生個体と冷水病菌株を解析し、疾病流行菌株の変異（移り変わり）と野生集団の遺伝的変異（宿主耐病性遺伝子の集積）との関連性を明らかにする（分子生態学的研究）。さらに、2つの耐病性責任遺伝子の組み合わせから、耐病性形質に対応する菌株グループを明らかにし（細菌学的研究）、耐病性メカニズムの解明（免疫学的研究）により、野生個体から耐病性個体選抜を可能にする分子育種法を開発する（育種学的研究）。
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魚類における耐病性責任遺伝子の同定と新規疾病が野生集団に与える遺伝的影響の解析
研究期間: 2020年04月 - 2024年03月 代表者: 坂本 崇
基盤研究(A) 研究代表者 20H00431
魚類において、細菌性疾病の耐病性メカニズムは解明されていない。本研究では、これまでの申請者らの研究グループにより、単一遺伝子座で支配されていることが明らかになった細菌性疾病（アユ冷水病）耐病性形質の責任遺伝子候補について解析し、その責任遺伝子を同定し、その機能解析から耐病性メカニズムを明らかする。また、自然河川で毎年採集されてきた野生個体（同一河川の疾病初発生前後）を用いて、新規疾病被害による野生集団の遺伝的変異（自然選択の痕跡）を明らかにする。さらに、耐病性責任遺伝子のDNA配列情報を用いて野生個体から耐病性個体選抜を可能にする分子育種法を開発する。
1. 魚類における細菌性疾病に対する責任遺伝子の同定・・・責任遺伝子が存在すると考えられるゲノム領域の候補遺伝子において、耐病性形質と関連性が示唆されるSNPが明らかになった。そこでこのSNPについて、岐阜県・長良川天然個体を用いた耐病性形質との関連解析を実施した結果、耐病性形質との関連性が示唆された。
2. 魚類における細菌性疾病に対する耐病性メカニズムの解明・・・責任遺伝子が存在すると考えられるゲノム領域に存在する遺伝子Cおける発現解析の結果、耐病性形質に関与ことが示唆された。そこで遺伝子Cについて、哺乳類用発現ベクターに組み込み、BALB 3T3細胞に導入した。発現ベクターのMycエピトープタグを利用して、導入遺伝子の発現を確認し、当該遺伝子産物を細胞表面に発現する細胞株を樹立した。これをBALB/c系マウスに接種して免疫し、定法にてモノクローナル抗体を作製した。樹立細胞株を用いた一次スクリーニングを免疫染色法で実施し、35の陽性クローンを得た。アユの白血球を用いた二次スクリーニングを行い、少なくとも陰性クローンよりも高い蛍光強度を有する2クローンを得ることができた。
3. 自然河川で新規に発生した疾病が野生集団に及ぼす遺伝的な影響の解明・・・本研究では、富山県庄川で1992年から2000年まで採集された流下仔魚を解析する。庄川では、1996年頃には顕著な冷水病の発生が確認されており、冷水病発生前後の解析が可能である。本年度は、冷水病発生前サンプルについて、耐病性形質との関連性が示唆された候補遺伝子について解析を実施し、遺伝情報データを収集した。
4. 責任遺伝子を用いた野生個体から耐病性魚を遺伝子選抜する新規育種技術の開発・・・岐阜県・長良川天然個体にピットタグを装着し、責任遺伝子候補のDNA情報で親魚候補を選抜・交配し、次世代を作出・維持管理した。
本年度は4項目を実施計画とした。研究項目1. 魚類における細菌性疾病に対する責任遺伝子の同定では、責任遺伝子が存在すると考えられるゲノム領域の候補遺伝子において、昨年度に明らかになった耐病性形質と関連性が示唆されるSNPに関して、岐阜県・長良川天然個体を用いた耐病性形質との関連解析を実施した。その結果、岐阜県・長良川天然個体においても耐病性形質との関連性が示唆されたことから信頼性は高く、十分に目標を達成したと考えられた。また、研究項目2. 魚類における細菌性疾病に対する耐病性メカニズムの解明においても、昨年度に発現解析によって耐病性形質に関与することが示唆された遺伝子において、その遺伝子産物を細胞表面に発現する細胞株を樹立すると共にモノクローナル抗体を作製し、少なくとも陰性クローンよりも高い蛍光強度を有する2クローンを得ることができたことから、目標を達成したと考えられた。研究項目3. 自然河川で新規に発生した疾病が野生 集団に及ぼす遺伝的な影響の解明については、富山県庄川の冷水病発生前サンプルについて、耐病性形質との関連性が示唆された候補遺伝子について解析を実施し、遺伝情報データを収集したことから、目的を達成したと考えられた。研究項目4. 責任遺伝子を用いた野生個体から耐病性魚を遺伝子選抜する新規育種技術の開発においては、岐阜県・長良川天然個体にピットタグを装着し、責任遺伝子候補のDNA情報で親魚候補を選抜・交配し、次世代を作出・維持管理したことから、目標を達成したと考えられた。以上のことから、本研究課題の進捗状況については、「おおむね順調に進展している」とした。
研究項目1. 魚類における細菌性疾病に対する責任遺伝子の同定では、これまでの分子遺伝学的解析で絞り込まれた（耐病性形質と関連性が示唆された）SNPについて、これまでの解析とは異なる河川のサンプルを用いて解析する予定である。
研究項目2. 魚類における細菌性疾病に対する耐病性メカニズムの解明では、これまでの分子遺伝学的解析で耐病性形質との関連性が示唆されたSNPが存在する候補遺伝子において、抗体を作製した。そこで、この抗体の有効性を確認するとともに、目的とする抗原を有する血球をフローサイトメトリーにより分取し、血球の種類、抗体を保有する血球割合などを解析する予定である。
研究項目3. 自然河川で新規に発生した疾病が野生集団に及ぼす遺伝的な影響の解明では、これまでの分子遺伝学的解析で耐病性形質との関連性が示唆されたSNPが存在する候補遺伝子を中心に、冷水病発生後サンプルについて解析を実施する予定である。
研究項目4. 責任遺伝子を用いた野生個体から耐病性魚を遺伝子選抜する新規育種技術の開発については、耐病性責任遺伝子候補のDNA配列情報で選抜・生産された耐病性形質を保持する候補群（耐病性区）および耐病性形質を 保持しない候補群（感受性区）について、感染実験を実施する予定である。 -
研究期間: 2020年04月 - 2023年03月 代表者: 吉崎 悟朗
基盤研究(A) 研究分担者 20H00430
養殖魚では、その評価が侵襲的になされる形質に着目した育種はほとんど着手されていない。対象個体の評価に伴い、その個体を殺してしまう必要が生じる場合、その次世代を生産できないことがその大きな理由である。ゲノム情報を駆使して集団選抜を行うことも理論的には可能ではあるが、これには多大なスペースと労力、コストを必要とする。さらに、親世代の集団にエリート個体が含まれていなかった場合、その効果は限定的である。本申請では、可食部のサンプリングの際に未熟な生殖細胞を単離・凍結し、エリート個体を同定した後に、エリート個体の凍結生殖細胞を代理親魚へと移植することで、エリート個体に由来する卵、精子の生産を目指す。
海産魚のニベをモデルに用いて粗脂肪含量の高い個体の育種が可能であるかを検証した。まず天然個体の粗脂肪含量を分析すると同時に、これらの個体の生殖腺を液体窒素内で凍結保存した。分析の結果、粗脂肪含量が高い個体と低い個体を特定した後、これらの生殖幹細胞を不妊宿主に移植した。その後、これらの宿主を成熟させた後、交配実験に供した。その結果、粗脂肪含量が高い個体の生殖細胞を移植した雌雄に由来する次世代は、低い個体の生殖細胞に由来する次世代より有意に高い粗脂肪含量を示すことが明らかとなった。これらの結果から、従来餌の影響を大きく受けると考えられてきた魚の脂ののりは遺伝することが明らかとなった。
従来、魚の脂の乗りは餌に大きく依存すると考えられてきたが、今回の研究で遺伝の影響も大きいことが明らかとなった。このことは、脂ののった魚を育種で生産可能であることを意味している。また、今回の研究では侵襲的な解析を行わないと評価できない表現型の育種が可能であることを明瞭に示すことができた。これにより、将来的には従来は未検討であった様々な新たな表現型に関する育種が進行することが期待される。 -
クルマエビの初期発生段階・雌雄別発現解析による性決定機構の解明
研究期間: 2019年04月 - 2024年03月 代表者: 伏屋 玲子
基盤研究(C) 研究分担者 19K06243
クルマエビの性差（雌＞雄）に着目し，性統御・全雌生産の可能性を検討するために性決定機構および性分化機構について解析する．これまでに開発した性連鎖マーカーを利用し，初期発生段階を継時的にサンプリングし，性連鎖マーカーにより各個体の性別を判定する．性別判定をした雌雄個体のRNAをそれぞれまとめ，RNA-seq解析を実施し，ごく初期に遺伝子発現の雌雄差が現れる遺伝子を性決定候補遺伝子として単離する．これらの候補遺伝子について，解析済みの家系における性連鎖解析を行い，性決定遺伝子の探索を行う．また，この継時的なサンプルによるRNA-seq解析により性分化機構に関与する遺伝子群も明らかにする．
クルマエビの新規ロングリード・ゲノムデータが公開され，そのリファレンスデータを用いて１家系のGRAS-Di解析データだけでなく，複数家系について再解析を行った。それぞれにおいて異なる性連鎖SNPが得られため，これらのSNPマーカーについてプライマーを設計した。また，2021年に海外で性連鎖SNPマーカーが報告されたため，そのマーカーのプライマーも用いて，天然のクルマエビおよび本課題で作成したクルマエビ家系について，PCRおよび電気泳動を行い，シーケンスデータから多型を調べ，解析からこれからの性連鎖SNPマーカーの位置関係についても解析をしている。
コロナ禍で分担研究機関(東京海洋大学)で実験，解析が実施しにくい期間があり，またDNAで複数家系を使用した詳細な解析を行ったため，RNA-seq（外注）の実施ができなかった。
本課題で得られた性連鎖SNPマーカーを用いて，幼生のDNAによる雌雄判別を行い，RNA-seq解析を実施する。発生段階初期に雌雄差のある遺伝子をリストアップすることにより，性連鎖マーカーと連鎖する候補遺伝子の探索を行う。 -
持続可能な養殖業の為の無魚粉無魚油飼料開発に関する基礎的研究
研究期間: 2019年04月 - 2023年03月 代表者: 佐藤 秀一
基盤研究(B) 研究分担者 19H03047
世界の水産養殖生産量は年々増大し、特に飼料を給餌して行う給餌養殖の生産量は養殖生産量の中でも、著しく増大している。このような状況のなかで、その飼料の主な原料となる魚粉および魚油の生産量は、その原料魚の資源保護のために著しく減少傾向にある。また，魚油に含まれているエイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)は海水魚の必須脂肪酸であり、陸上の植物では生産できない脂肪酸である。そのため，魚油に依存する養殖用飼料を給餌し続けると，水生動物の減少や養殖生産量の増大も図れない。そこで，魚油に頼らない生産するための利用するための必要な基礎的知見の集積を行う。
持続可能な養魚飼料開発の為に、海水魚用無魚粉・無魚油飼料の開発のための基礎的研究を行った。海水魚は必須脂肪酸としてEPAやDHAを要求するが、そこでDHAを多量に産生する微細藻類の一種、シゾキトリウムを乾燥した粉末を用いて、無魚粉・無魚油飼料の開発を行った。先ず、マダイを用いて、要求量を満足するようにシゾキトリユウム粉末を配合し、給餌した結果、魚粉・魚油配合飼料と遜色の無い、飼育成績が得られた。同様に、ブリを用いて、実験を行ったが、摂餌が極端に悪く、ほとんど成長しなかった。そこで、摂餌誘因物質を添加することにより摂餌が改善され、魚油配合飼料と同様の成長が得られた。
世界的に水産養殖が発展し、飼料の重要性が増して来た。そこで、魚類栄養学の持つ意味も非常に重要になった。本研究成果は魚類の脂質要求に関する基礎的・応用的研究であり、海水魚の脂質代謝に関する遺伝子発現情報や微細藻類に含まれる脂質の魚類における利用性を明らかにすることができたのみにかかわらず、海水魚における無魚粉無魚油飼料の開発に成功し、持続可能な水産養殖業を行う為の基礎的知見が得られたものと思われる。 -
人工シラスウナギの大量生産技術の確立と社会実装に関する統合的研究
研究期間: 2019年04月 - 2022年03月 代表者: 塚本 勝巳
基盤研究(A) 研究分担者 19H00946
本研究ではウナギの完全養殖技術の確立を目指し、（１）人工催熟した親魚の生殖形質の組織学的・分子生物学的解析から、従来の低卵質の問題を改善する。次に、（２）仔魚の味覚・嗅覚受容機構の基礎研究から餌料嗜好性を明らかにして最適な人工餌料を開発する。また（３）仔魚のストレス応答の研究から高密度飼育を実現する新飼育システムを考案する。そして、（４）仔魚の変態機構の研究を基に、変態のタイミングを揃える技術を開発する。さらには、（５）マーカー育種による選抜を行い、高成長・早期変態の優良家系を作出する。以上統合して大量種苗生産のシステム化を行い、社会実装を図る。
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ブリ類のホットスポット東シナ海から日本産ブリ類の由来と進化を探る
研究期間: 2019年04月 - 2022年03月 代表者: 阪倉 良孝
基盤研究(A) 研究分担者 19H00952
本研究では，我が国の主要水産魚であるブリ類（ブリ，ヒラマサ，カンパチ等）の由来と進化が東シナ海で起こっているという仮説を立てた。この仮説を検証するために，東シナ海でのブリ類の産卵回遊をバイオロギングによって追跡し，産卵期と産卵場を特定する。そして，これらの魚種のゲノム解析を実施し，系統類縁関係を再精査する。これらの情報を統合することで，各々の種がいつどこでどのようにして種分化をするに至り，多様な生態を持つようになったのかを考察するとともに，各々の種の持続的利用について主に産卵生態からの資源管理提言の基礎資料に資する。
ブリ属3種の東シナ海における回遊パターンを調べた。ブリに、既知の日本海を南北に回遊する群に加え、新たに東シナ海に留まる群を発見した。カンパチの産卵場を台湾東部に特定したが、日本側に生息する個体は地先水域に留まった。対馬海峡周辺でヒラマサの仔魚を初めて多数採集し、ヒラマサの産卵場推定の鍵を得た。ヒレナガカンパチの全ゲノムデータを得て、ブリ属4種の進化的特徴と、交雑の可能性を検討する基盤を整えた。その結果、ブリ属内で複数の種間交雑を発見し、近年の日本近海の環境変動によりブリ属の種の境界がゆらいでいるという仮説が提示された。また、ブリ属の性決定遺伝子がHsd17b1遺伝子であることを明らかにした。
これまでブリ属のすみ分けがなされていた東シナ海において、複数の種間で産卵場と産卵期の重複による種間交雑の起こっていることが示され、環境変動の影響により種の境界が揺らいでいることが示唆された。また、ヒラマサとカンパチの主産卵場が我が国の経済水域外にあることが分かった。ブリ稚魚の採捕について我が国は許可漁業制を布いており、この漁業管理の奏功がブリの良好な資源状態の維持に一役買っていると考えられる。一方、ヒラマサとカンパチについては、稚魚の漁獲規制が曖昧で、また、産卵場が国外にあることから、より詳細な繁殖生態と系群に関わる科学的な知見を集積して、国際協調による資源管理にあたる必要があると考える。 -
ゲノム編集とターゲットシークエンスによる特定ゲノム領域内の責任遺伝子単離の高速化
研究期間: 2018年04月 - 2021年03月 代表者: 中本 正俊
基盤研究(C) 研究分担者 18K05816
アユの養殖では子持ちアユとしてメスが珍重されており、全雌生産のために遺伝的性判別のニーズが存在する。本研究ではこれまでの天然魚を用いた遺伝解析により同定された雄特異的なゲノム領域に位置する性決定遺伝子候補についてゲノム編集を行いその機能を明らかにすることを目的とした。 その結果、性決定遺伝子候補に変異が導入された遺伝的雄個体では卵巣が形成された。次に生殖腺の性分化前の個体についてアユ性決定遺伝子候補のmRNAの発現を解析した。性決定遺伝子候補は遺伝的雄個体でのみ生殖細胞を取り囲む体細胞で発現が検出され、この遺伝子によってアユの性が決まることが示された。
水産重要種であるアユの養殖においては子持ちアユとしてメスが珍重されており、全雌生産のために遺伝的性判別のニーズが存在する。アユはXX-XY型の性決定様式でありY染色体上の性決定遺伝子によって性が決まると考えられている。本研究によりアユの性決定遺伝子が同定され、確実に遺伝的性を判別できる遺伝マーカーが開発されたことにより、遺伝的性を養殖の初期段階で判別することでより多くの雌を生産することが可能となる。またXX個体に対してホルモン処理等の性転換処理を行いXX雄を作出することで全雌生産ができるようになる。 -
ウイルス耐病性責任遺伝子を用いた天然魚における遺伝子選抜育種技術の開発
研究期間: 2016年04月 - 2020年03月 代表者: 坂本 崇
基盤研究(B) 研究代表者 16H04970
ヒラメは重要な養殖魚の一種である。リンホシスチス病は、ヒラメ養殖に被害を与えており、対策が必要な疾病の一つである。本研究では、リンホシスチス病に対する耐病性責任遺伝子の同定を試みると共に、責任遺伝子を用いた天然魚からの選抜技術の開発を行った。
本研究の成果は、1）天然採捕した成魚や個別タグをつけることが出来ない稚魚において、それらを生かしたまま遺伝子型判別や塩基配列情報を入手し、選抜する技術開発に成功したこと、2）耐病性形質についても天然採捕した稚魚を用いた関連解析が可能であること、3）天然採捕した稚魚における耐病性形質の関連解析で相関が考えられる一塩基多型が検出されたこと、があげられる。
本研究では、リンホシスチス病に対する耐病性責任遺伝子の同定を試みると共に、その責任遺伝子を用いた天然魚からの選抜技術の開発を行った。天然集団の中にリンホシスチス耐病性形質を保持する個体が少ないため、まだ統計的に有意な結果にはならなかったが、相関解析などの成果からこれまでの耐病性責任遺伝子候補がやはり有力な遺伝子候補であることが明らかになった。本研究成果により、天然魚において耐病性責任遺伝子を用いて直接的に耐病性個体を選抜し、新規耐病性系統を作れる可能性を示したと考えている。 -
国際協働による回遊性水産重要種の初期生態解明～東シナ海のブリ属をモデルとして～
研究期間: 2016年04月 - 2019年03月 代表者: 阪倉 良孝
基盤研究(B) 研究分担者 16H05794
日台共同で東シナ海に分布するブリ属魚類のカンパチ（Seriola dumerili）の共同調査を行った。本研究期間中に，総計362個体を採集し，これらのうち産卵群の遺伝的特性を反映すると予測される当歳魚67個体を選別し，耳石による日齢査定，およびミトコンドリア調節領域DNAとDNAマイクロサテライトの解析に供した。その結果，本種は台湾北岸から東シナ海南部の陸棚縁辺部で1～4月に産卵すると考えられた。ミトコンドリアDNAおよびマイクロサテライトDNA解析（4マーカー×2セットのマルチプレックス解析）の解析から，東シナ海に出現するカンパチの当歳魚は単系群であると判断された。
東シナ海は，日中韓台の4カ国が海洋水産資源を利用する国際水域であるが，各々の国の利害関係や政治的関係によって国境を跨がった水産資源共同調査の実施は困難を極めてきた。この理由により，亜熱帯性ブリ類の産卵水域に我が国からアクセスすることも困難であった。本研究課題によって，台湾の水産研究機関と国際共同研究を立ち上げ，亜熱帯性ブリ類の産卵水域の調査が可能となり，謎の多かった亜熱帯性ブリ類の初期生態研究に大きな進展をみた学術的意義は大きい。さらに，このように実効性に富んだ国際水域を跨がる回遊魚の共同調査体制を構築した社会的意義も極めて大きいと自己評価している。 -
研究期間: 2014年04月 - 2019年03月 代表者: 塚本 勝巳
基盤研究(A) 研究分担者 26252030
ウナギの人工種苗生産技術の開発研究における卵質問題，仔魚の初期餌料開発，飼育方法の改良，優良家系の作出について基礎・応用の両面から研究を行ったところ，ホルモン投与に依存しない雌化技術として稚魚の単独飼育が有効であること，卵内の母性mRNAの局在異常が卵質悪化の原因であること，味覚受容細胞は仔魚の口唇を中心に局在すること，味覚受容体遺伝子の発現が仔魚の発達や栄養条件に応答すること，餌の粘度が仔魚の摂餌・嚥下に大きく影響すること，育種価上位個体は完全養殖第4世代を親にもつ一部の家系に偏り，育種効果が確認できたことなど，多くの有用な知見が得られた．
ウナギの種苗生産技術の確立のために避けて通れない卵質問題の改善，仔魚の初期餌料の開発，飼育方法の改良，優良家系の作出について，基礎・応用の両面で数多くの重要な知見が得られた．ニホンウナギの資源は近年大きく減少し，国際自然保護連合の絶滅危惧種にも指定された．今回の研究による成果は，長年待ち望まれてきた人工シラスウナギの完全養殖技術の完成を大きく加速し，天然のシラスウナギ資源に依存しない持続的なウナギ養殖への道を拓いた．